La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste Danois Hans Christian Gram (1853-1938) qui mit au point le protocole en 1884.
La coloration de Gram permet de différencier la paroi bactérienne et de scinder les bactéries en deux grands groupes.
Les bactéries présentent toutes une paroi constituée d’une substance, la muréine qui est un peptidoglycanne.
* Bactéries Gram – : leur paroi n’est formée que d’une seule couche de peptidoglycanne, raison pour laquelle elles possèdent une membrane externe lipidique … (elles sont plus perméables à l’alcool)
* Bactéries Gram + : leur paroi est formée d’une quarantaine de couche de peptidoglycanne (paroi épaisse) ; elles ne possèdent pas de membrane externe.
L’avantage de cette méthode est de donner une information rapide, facile et bon marché sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu, tant sur le type que sur la forme.
Ce type de classification n’est pas sans conséquence dans le domaine médical (la résistance des bactéries et l’efficacité d’antibiotiques dépendant du type de bactérie).
La coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en bactériologie médicale :
Elle permet de colorer les bactéries et de les distinguer à l’examen direct par leur aptitude à fixer :
– le Violet de gentiane (Gram +),
– ou la Safranine ou Fuchsine (Gram -).
Ces différences de coloration et les différences de forme (bacille ou cocci) sont à l’origine de la classification des bactéries.
1. Méthodologie :
1) Fixation du frottis :
Elle nécessite d’avoir un frottis fixé, soit :
– par l’alcool durant 5 minutes (et rinçage à l’eau),
– plus classiquement en effectuant une fixation simple à l’eau : sur une lame de microscope, déposer une goutte d’eau stérile avec l’aide d’une anse que l’on aura préalablement stérilisé (en la passant sous le bec benzène), (ou directement le prélèvement s’il est liquide).
Ajouter à la goutte une colonie isolée (dans le cas où un isolement a été fait).
On procède à la fixation du frottis soit avec de l’éthanol à 90° (5 minutes) puis on enflamme la lame ou on passe directement 3 fois la lame dans la flamme du bec Bunsen.
2) Réalisation de la coloration :
Voici succinctement les différentes étapes de cette coloration :
1- Coloration au Violet de Gentiane (Cristal violet) : la lame est plongée pendant 1 minute dans cette coloration (toutes les bactéries sont colorées en violet), puis rincer à l’eau déminéralisée.
2- Mordançage au Lugol : étalez le Lugol et laissez agir le même temps que le violet de gentiane ; rincez à l’eau déminéralisée.
Cette étape permet de stabiliser la coloration violette.
3- Décoloration (rapide) à l’alcool (+ acétone) : c’est l’étape la plus importante de la coloration : versez goutte à goutte l’alcool ou un mélange alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveillez la décoloration qui doit être rapide (10 secondes).
Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. L’alcool pénètre dans la bactérie ⇒ la coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries décolorées sont des bactéries Gram-.
Si l’alcool ne traverse pas la paroi, on est en présence de bactéries Gram+.
Puis rincer sous un filet d’eau déminéralisée.
4- Contre coloration à la Safranine (ou à la Fuchsine) : Mettez de l’eau distillée sur la lame et quelques gouttes de safranine. Laissez agir 1 minute. Lavez doucement à l’eau déminéralisée. Séchez la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.
Les bactéries Gram- sont colorées en rose.
5- Observez avec une goutte d’huile à immersion objectif 100 (grossissement ×1000).
Les étapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de la bactérie. Le Violet de gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le Lugol permet de fixer cette coloration interne.
L’étape 3 (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites “Gram négatif”. En effet, celles-ci ont une paroi pauvre en peptidoglycanes – donc plus fine – qui va laisser passer l’alcool (molécule hydrophile) ou le mélange alcool-acétone, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le Violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites “Gram positif” la paroi constitue une barrière imperméable à l’alcool car elle est composée d’une “couche” de peptidoglycanes plus importante, donc de ce fait plus épaisse. Elles resteront alors de couleur violette.
L’étape 4 est une contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries Gram négatives précédemment décolorées une teinte rose permettant de les visualiser au microscope. Les bactéries à Gram positif restées violettes seront évidemment insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur cytoplasme.
2. Utilisation en microbiologie :
La coloration de Gram est fréquemment utilisée en microbiologie pour mettre en évidence les bactéries Gram positif/négatif. Cela permet de différencier et de classer les différentes populations de micro-organismes.
Les bactéries détectées sont classées en deux catégories. A titre d’exemple :
– Les staphylocoques et les streptocoques, bactéries à Gram +, apparaissent en violet ou mauve.
– Escherichia coli, entérobactérie à Gram -, apparaît sous forme de bacille rose ou rouge (en fonction de la contre-coloration Safranine ou Fuchsine).
Points clés
La coloration de Gram est fondée sur l’action successive d’un colorant : le Cristal violet, d’iode puis d’un mélange d’alcool et d’acétone.
Dans un premier temps, le colorant (Cristal violet) pénètre dans la paroi et le cytoplasme.
Dans un second temps, l’iode réagit avec le colorant et le rend insoluble.
La perméabilité plus grande des bactéries à Gram négatif à l’alcool permet la décoloration +++.
Les bactéries à Gram positif restent colorées en violet ou mauve.
Une contre-coloration (en rose) permet de visualiser à nouveau, les corps cellulaires des bactéries à Gram négatif.
Bactérie à Gram + : bactérie qui reste colorée en violet.
Bactérie à Gram – : bactérie qui élimine le Cristal violet et apparaît rose.
